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冷凍干燥機在山東產忍冬藤乙酸乙酯部位化學成分分離鑒定的應用

[導讀]對山東道地藥材忍冬藤的乙酸乙酯部位進行系統的化學成分研究。

  忍冬藤屬于臨床常用中藥,具有清熱解毒、疏風通絡的功效,常用于溫病發熱、熱毒血痢、癰腫瘡瘍、風濕熱痹、關節紅腫熱痛。目前對忍冬藤的研究主要集中在化學成分和藥理活性上。根據查閱文獻,發現忍冬藤與忍冬的花( 金銀花) 具有相近的化學成分和藥理活性,忍冬藤的化學成分主要包括有機酸類、環烯醚萜類、三萜類、黃酮類、揮發油類等,藥理方面能解熱、抗炎、抗病毒、抗腫瘤、調節機體免疫等。另一方面,忍冬藤藥材資源較金銀花更為豐富,卻不如金銀花臨床使用和開發利用廣泛,價格也較為低廉。為進一步開發利用山東地區的忍冬藤藥材資源,本實驗前期對山東產忍冬植物的不同藥用部位進行了抗氧化活性研究,發現其不同藥用部位、不同極性提取物均具有較好的抗氧化能力,乙酸乙酯萃取物清除能力最強,正丁醇萃取物次之。從忍冬藤中分離得到了對羥基肉桂酸甲酯、咖啡酸乙酯、咖啡酸甲酯、阿魏酸、咖啡酸、綠原酸,進一步的體外抗氧化活性研究,發現這些化合物具有較強的抗氧化活性。

  本文對忍冬藤抗氧化活性較強的乙酸乙酯部位進行了系統的化學成分分離,從中分離并鑒定了10個化合物,分別為丁香酸( 1) ,烏蘇酸( 2) ,松脂素( 3) ,齊墩果酸( 4) ,香葉木素( 5) ,β-谷甾醇( 6) ,肉桂酸( 7) ,芹菜素( 8) ,木犀草素( 9) ,槲皮素( 10) ,其中化合物1 ~ 3 系首次從忍冬植物中分離得到,4 ~ 5 系首次從忍冬藤中分離得到。其中化合物4已從忍冬的花中分離得到,化合物5 已從忍冬葉中分離得到。兩者均未見自忍冬藤中分離得材料AVANCE 500 型超導核磁共振儀和Esquire3000 plus 型質譜儀( 德國Bruker 公司) ,1100LCMSD型液相色譜-質譜聯用儀和1100 系列高效液相分析儀( 美國Agilent 公司) ,N-2100 型旋轉蒸發儀( 日本東京理化器械株式會社) ,U-3000 型紫外-可見分光光度計( 日本Hitachi 公司) ,Scientz-10N真空冷凍干燥機( 寧波新芝生物科技股份有限公司) ,ZF-2 型三用紫外分析儀( 上海市安亭電子儀器廠) 。95%乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、二氯甲烷、甲醇、無水硫酸鈉、冰乙酸均為分析純,甲醇、乙腈色譜純,Methanol-d4( 氘代試劑,青島騰龍微波科技公司) ,DMSO-d6( 氘代試劑,青島騰龍微波科技公司) 。柱色譜用硅膠( 200 ~ 300,300 ~ 400 目) ,G254硅膠薄層板( 青島海洋化工廠) ,LH-20 型羥丙基葡聚糖凝膠( Sephadex LH-20,Amersham Biosciences 公司) 。

  忍冬藤采自山東雙花制藥公司金銀花規范化種植基地,經山東中醫藥大學張永清教授鑒定為忍冬科植物忍冬Lonicera japonica 的莖藤,標本存放于山東省醫學科學院藥物研究所。



分離與純化

   取山東產忍冬藤藥材50 kg,粉碎成粗粉,加70%乙醇提取3 次,合并提取液,減壓回收溶劑得浸膏。取浸膏加適量水分散,分別用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇分步萃取,得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物。取忍冬藤乙酸乙酯萃取物( 391 g) ,加適量乙酸乙酯溶解后上硅膠柱色譜,以二氯甲烷-甲醇( 100 ∶ 0 ~ 1 ∶ 1) 梯度洗脫,以硅膠薄層色譜指導合并相同組分,得到10 個流分Fr. 1 ~Fr. 10。組分Fr. 4 上硅膠柱色譜,以二氯甲烷-甲醇( 100 ∶ 0 ~ 1 ∶ 1) 梯度洗脫,以硅膠薄層色譜合并相同組分,得到176 個小瓶,對第51,81,94,98 小瓶中粗析出物進行重結晶,得到化合物6( 8 mg) ,7( 5 mg) ,2( 50 mg) ,4( 6 mg) ; 對第176 個小瓶組分進行反復硅膠柱色譜及Sephadex LH-20 柱色譜,分離得到化合物1( 5 mg) ,3( 4 mg) ,5( 6 mg) ; 組分B6 經反復硅膠柱洗脫( 石油醚-乙酸乙酯、二氯甲烷-甲醇系統) ,MCI 柱色譜,Sephadex LH-20 等,TLC,HPLC 跟蹤檢測,結合重結晶,分離得到化合物8 ( 7 mg) ,9( 12 mg) ,10( 6 mg) 。



討論

  為充分開發利用山東地區豐富的忍冬藤藥材資源,本實驗對山東產忍冬藤乙酸乙酯部分進行了化學成分研究和抗氧化活性初步研究,共分離得到10個化合物,其中3 個化合物系首次從本植物中分離得到,2個化合物系首次從忍冬藤中分離得到。以維生素C 為陽性,利用DPPH 比色法對忍冬藤乙酸乙酯粗提物和分離得到的單體化合物進行體外抗氧化活性研究,發現忍冬藤乙酸乙酯粗提物以及單體化合物丁香酸、肉桂酸、香葉木素、芹菜素、木犀草素、槲皮素的抗氧化能力較強,而烏蘇酸、齊墩果酸和β-谷甾醇的抗氧化能力較弱,可以看出其中的黃類成分和有機酸類成分抗氧化活性較強,推測忍冬藤化學成分的抗氧化活性應該與其含有的活潑酚羥基有關。本研究將為忍冬藤的進一步開發利用和臨床應用提供科學依據,同時表明忍冬藤是一種具有進一步開發利用和研究價值的天然抗氧化劑。



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