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細胞粉碎機在紅球菌菌株腈水合酶提取方法的優化

[導讀]研究了紅球菌(Rhodoccus sp. Tccc28001)腈水合酶初步提取實驗.

腈水合酶(NHase,EC 4.2.1.84)能通過水合反應將腈類物質轉化成酰胺.這種生物催化劑符合綠色化工的需要,在生物轉化中具有重要的研究和應用價值.腈水合酶是能催化帶有-C≡N 功能基團的化合物的金屬酶.其產物如丙烯酰胺和尼克酰胺等在飼料、化工、醫藥、造紙、樹脂及紡織服裝等領域具有廣泛的應用.用腈水合酶生產酰胺類化學品具有成本低、能耗低及污染少等優點.紅球菌(Rhodoccus sp.Tccc28001)菌株內的腈水合酶具有寬泛的底物譜,能水合脂肪腈、芳香腈和雜環腈,同時對二腈具有很強的區域選擇性.因此,研究該菌腈水合酶的提取具有重要意義.



儀器與試劑

儀器與菌株

Agilent1100型高效液相色譜分析儀(美國Agilent公司);Kromasil 100-5 C18色譜柱,4.6 mm×250 mm(日本JEOL公司);超聲細胞勻漿儀寧波新芝生物科技有限公司);TCL-12型臺式高速冷凍離心機(Thermo公司,USA);Gilson微量取樣器(Gilson Electronics公司,France);AB204-S型分析天平(Mettler Toledo公司).菌株Rhodoccus sp. Tccc28001(現名:Rhodococcus rube.CGMCC3090)分離于天津近郊受污染土壤樣品,保藏于齊齊哈爾大學分子實驗室.

培養基與緩沖液

  培養基的配制 實驗采用的斜面培養基、種子培養基和發酵培養基的配制和使用均同文獻.

  40 mmol/L 磷酸鉀緩沖液(pH7.2)的配制 首先配制100 mmol/L 磷酸鉀緩沖液(pH7.2):取6.8045 g KH2PO4 用蒸餾水定溶至500 mL 作為A1 液;另取22.822 g K2HPO4·3H2O 用蒸餾水定容至1 L 作為A2液.分別在121 ℃滅菌30 min,按A1與A2 體積比為283∶717 混合,即為100 mmol/L 磷酸緩沖液.用時取該緩沖液400 mL 加蒸餾水600 mL 即可.



實驗方法

生長曲線測定和菌體酶活力測定

  根據紅球菌的生長曲線確定培養時間.取10 個裝有100 mL 發酵培養基并已接菌的250 mL 的三角瓶,按發酵培養條件培養,分別在12,24,36,48,60,72,84,96,108,120 h 取樣,將細菌培養物稀釋50倍,以同樣稀釋倍數的空白培養基作為對照,用UVmini-1240 紫外可見分光光度計在600 nm 波長處測定OD 值,以確定菌體的生長曲線.并對上述不同時間取樣的培養液(菌懸液)進行相對酶活力檢驗.

菌體收獲、重懸和超聲處理

  96 h 培養后的發酵產物用高速冷凍離心機(4 ℃)8 000 r/min 離心30 min 收集菌體,菌體沉淀用40mmol/L 的磷酸鉀緩沖液(pH7.2)洗滌2 次,得到菌體懸液.并用適量同樣的緩沖液重懸菌體,進行超聲破碎.超聲波處理分為2 種情況:一種是超聲前加入適當溶菌酶(每50 mL 菌懸液加入100 μL 溶菌酶,即100 μg/mL 溶菌酶,溶菌酶在4 ℃下處理菌懸液40 h),另一種不加溶菌酶.超聲處理分2 次進行,每次30 min(15 s 超聲,15 s 間隔;每個循環30 s 共60 個循環).

硫酸銨分級分離

  分別稱取已在100 ℃烘干2 h 的硫酸銨0.106,0.146,0.206,0.291,0.361,0.436,0.516,0.603,0.697g 于1.5 mL 離心管中,各管放置于冰上,用移液槍分別移取1 mL 無細胞提取物加入其中,分別形成20%,30%,40%,50%,60%,70%,80%,90%,100%飽和度的硫酸銨溶液(0 ℃),搖勻后放冰箱中靜置4 h,備用.取出后在4 ℃,12 000 r/min 離心20 min,收集沉淀,沉淀用同樣體積的40 mmol/L 磷酸鉀緩沖液(pH7.2)重懸.測定腈水合酶相對酶活力,得硫酸銨分級鹽析曲線,從而確定硫酸銨分級鹽析的最佳條件.

透析除鹽

  把截留分子量為10 kD 的透析袋剪成適當長度(10~20 cm)的小段備用.在大體積1 mmol/L EDTA(pH8.0)的溶液中將透析袋煮沸10 min,用蒸餾水徹底清洗透析袋.分別將上述硫酸銨分級分離重懸液裝入其中,兩端夾緊后放入1 000 mL 25 mmol/L 磷酸緩沖液(pH7.2)中進行透析.用磁力攪拌器緩慢攪拌以促進溶液交換.之后放入4 ℃冰箱透析數小時,以達到透析平衡,更換透析緩沖液數次,使原有緩沖液中的鹽成分逐漸減少,以便測定腈水合酶活力.

腈水合酶相對酶活力測定

  轉化液的制備和產物濃度的測定:每次取一定稀釋度的100 μL 菌懸液(或粗酶液)加入到1.4 mL 含8%煙腈溶液的1.5 mL 離心管中,28 ℃震蕩5 min,加入20 μL 5 mol/L HCl 終止反應.轉化液12 000 r/min離心15 min,用0.22 μm 水相濾膜過濾,把轉化液進行一定倍數的稀釋,進樣量為20 μL.采用Kromasil 100-5C18 色譜柱,在高效液相色譜(HPLC)上檢測煙酰胺的峰面積.檢測器為G1322ADEGASSER G1314VWD檢測器,檢測波長為260 nm,柱溫為30 ℃;流動相比例為甲醇∶冰乙酸∶水=30∶1∶70,流速為1 mL/min.在上述色譜條件下,測得不同標準樣的峰面積,以峰面積的百分比代表腈水合酶的相對酶活力.



討論

  本研究對Rhodoccus sp.Tccc28001 細胞內腈水合酶的提取方法進行了優化,獲得了紅球菌細胞的最佳培養條件和最佳收獲時間;研究了超聲破碎處理方法,比較了加入溶菌酶和不加溶菌酶對超聲處理的影響,獲得了最佳超聲方法;進行了硫酸銨沉淀方法的優化;最后獲得了最高酶活力腈水合酶的粗提方法,為今后對腈水合酶通過層析方法進行純化奠定了基礎,也為后續研究腈水合酶的酶學性質提供了數據.



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