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銀耳芽孢總蛋白提取方法

[導讀]采用超聲波與高壓均質破碎細胞,通過顯微觀察細胞破碎效果、Bradford法測定蛋白含量并進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析,比較了三羥甲基氨基甲烷(tris(hydroxymethyl)methyl aminomethane,Tris)-飽和酚法、三氯乙酸(trichloroacetic acid,TCA)-丙酮沉淀法及Tris-飽和酚結合TCA-丙酮沉淀法提取銀耳芽孢總蛋 白的效果。

  銀耳(Tremella fuciformis),又名白木耳,是一種著名的藥食兩用真菌,富含多糖、蛋白質、維生素及無機鹽,被譽為“菌中之冠”。在醫藥領域,銀耳多糖具有提高免疫、抗腫瘤、抗氧化及抗衰老等生理功能,如減輕化療和放療的毒副反應,增強療效,提高癌癥患者的生存質量及延長生存期;銀耳多糖中的特定成分在臨床上可與其他藥物配伍用于治療放療、化療或其他原因引起的白細胞減少癥,亦可作為放射損傷的輔助治療;銀耳酚酸具有抗氧化及抗炎作用等生理功能。在食品加工領域,銀耳可被添加到食品中以改善其感官特性及提高營養價值,如在肉餡的制作中添銀耳子實體既能降低油膩度又能提高肉餡的持油性;在制作面包時用銀耳子實體代替5%的小麥粉,其感官特性可被接受且營養價值得到了提高;進一步用銀耳菌絲體代替子實體制作面包,也能取得同樣的效果。

  長期以來對于銀耳生理功能的研究主要集中在銀耳多糖及酚酸等方面,而蛋白質作為銀耳中第二大類營養成分,對其生理功能的研究較少。銀耳總蛋白的有效提取是進行銀耳蛋白質生理功能研究的重要前提,不同食用菌材料的最適提取方法不同,在對虎奶菇菌絲體自溶蛋白質制備方法的研究中,比較了超聲波和液氮研磨兩種細胞破碎方法,發現液氮研磨得到的粗蛋白和純蛋白產量均高于超聲波法;在草菇菌絲及子實體總蛋白的提取中采用了三氯乙酸(trichloroaceticacid,TCA)-丙酮沉淀法;在靈芝子實體原基總蛋白質的提取中,比較了三羥甲基氨基甲烷(tris(hydroxymethyl)methyl aminomethane,Tris)-飽和酚法和TCA-丙酮沉淀法的提取效果,而有關銀耳總蛋白的提取目前卻鮮有報道。

  銀耳芽孢是銀耳擔孢子產生的酵母狀分生孢子,俗稱“芽孢”(yeast-like conidia,YLC),比菌絲體及子實體更易獲得。本研究以銀耳芽孢為材料,在液氮研磨的基礎上分別采用超聲波與高壓均質進行細胞破碎,比較Tris-飽和酚法、TCA-丙酮沉淀法及Tris-飽和酚結合TCA-丙酮沉淀法3 種方法提取銀耳芽孢總蛋白的效果,旨在建立一種有效的銀耳芽孢總蛋白提取方法,為后續銀耳蛋白質生理功能的探索、蛋白質組學的研究及在食品加工中的應用奠定基礎。



材料與方法

材料、培養基與試劑

  銀耳3號芽孢華中農業大學食品科學技術學院食品微生物實驗室保存。

  馬鈴薯葡萄糖瓊脂(potato dextrose agar,PDA)培養基、馬鈴薯葡萄糖肉湯(potato dextrose broth,PDB)培養基青島日水生物技術有限公司。硫脲、脲、TCA、甲醇、乙醇、乙酸銨、Tris、HCl、乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetica c i d , E D TA) 、冰醋酸、硝酸銀國 藥 集 團化學試劑有限公司; 3 - [ ( 3 - 膽固醇氨丙基)二甲基氨基] - 1 -丙磺酸(3-[(3-cholamidopropyl)dimethylammonio]propanesulfonate,CHAPS)、二硫蘇糖醇(DL-dithiothreitol,DTT)、苯甲基磺酰氟(phenylmethylsulfonyl fluoride,PMSF) 合肥Biosharp公司;丙酮天津市天力化學試劑有限公司;載體兩性電解質北京酷來搏科技有限公司;考馬斯亮藍R-250、Tris-飽和酚北京索萊寶科技有限公司。



儀器與設備

  臺式冷凍離心機美國Beckman公司;AH-100B高壓均質機安拓思納米技術(蘇州)有限公司;超聲波細胞粉碎機寧波新芝生物科技股份有限公司;凝膠成像系統美國Bio-Rad公司;UV-1800紫外-可見分光光度計日本Shimadzu公司;超低溫冰箱美國ThermoFisher Scientific公司;顯微成像系統德國Leica公司。

方法

銀耳芽孢的培養

  將保藏的銀耳3號芽孢菌種轉管于PDA培養基上,活化3~6 d,接入裝有100 mL PDB培養基的250 mL三角瓶中。于25 ℃搖床上120 r/min培養3~5 d,10 000 r/min離心20 min,蒸餾水沖洗,再次離心,冷凍干燥后保存于-20 ℃冰箱,備用。

銀耳芽孢總蛋白的提取

Tris-飽和酚法

  稱取0.1 g銀耳芽孢,液氮研磨后,加5 mL抽提液(0.1 mol/L pH 8.8 Tris-HCl、0.01 mol/L EDTA、0.01 mol/LPMSF、0.05 mol/L DTT,下同)。經195 W、10 min或120 MPa、5 min破碎后,4 ℃、12 000 r/min條件下離心30 min,保留上清液。按1∶1(V/V)加入Tris-飽和酚,室溫混懸后4 ℃、12 000 r/min條件下離心30 min,保留酚

相。在酚相中加入0.1 mol/L pH 8.8 Tris-HCl及0.01 mol/LDTT后再加入4 倍體積甲醇(含0.01 mol/L 乙酸銨(乙酸銨-甲醇(1∶24,V/V))及0.01 mol/L DTT(DTT-甲醇(1∶480,V/V))),-80 ℃沉淀1 h以上,4 ℃、12 000 r/min條件下離心30 min。沉淀用預冷的90%乙醇(含0.01 mol/L DTT(DTT-乙醇(1∶100,V/V))洗滌2~3 次,4 ℃、12 000 r/min離心20 min。蛋白沉淀物室溫干燥后,加入溶解液(8.5 mol/L脲、2.5 mol/L硫脲、5% CHAPS、1%載體兩性電解質、0.1 mol/L DTT,下同)中,室溫混懸1 h,4 ℃、12 000 r/min條件下離心30 min,上清即為蛋白質樣本溶液。

TCA-丙酮沉淀法

  稱取0.1 g銀耳芽孢,液氮研磨后,加入5 mL裂解液(7 mol/L脲、2 mol/L硫脲、4% CHAPS、0.5%載體兩性電解質、0.05 mol/L DTT、蛋白酶抑制劑混合物,下同)。經195 W、10 min或120 MPa、5 min破碎后,4 ℃、12 000r/min條件下離心30 min,保留上清。加入5 倍體積預冷的10 g/100 mL TCA-丙酮溶液,混勻后-20 ℃冰浴30 min。4 ℃、12 000 r/min條件下離心30 min,棄上清。沉淀用預冷的丙酮洗滌2~3 次,4 ℃、12 000 r/min條件下離心20 min,去除殘留的TCA和丙酮。蛋白沉淀物室溫干燥后,加入溶解液中,超聲波使其充分溶解,室溫混懸1 h,4 ℃、12 000 r/min條件下離心30 min,上清即為蛋白質樣本溶液。

Tris-飽和酚結合TCA-丙酮沉淀法

  稱取0.1 g銀耳芽孢,液氮研磨后,加入5 mL裂解液。經195 W、10 min或120 MPa、5 min破碎后,4 ℃、12 000 r/min條件下離心30 min,保留上清。加入5 倍體

積預冷的10 g/100 mL TCA-丙酮溶液,混勻后-20 ℃冰浴30 min。4 ℃、12 000 r/min條件下離心30 min,棄上清。沉淀用預冷的丙酮洗滌2~3 次,4 ℃、12 000 r/min條件下離心20 min,去除殘留的TCA和丙酮。沉淀室溫干燥后,加入5 mL抽提液,4 ℃、12 000 r/min條件下離心30 min,保留上清。按1∶1(V/V)加入5 mL Tris-飽和酚,室溫混懸后4 ℃、12 000 r/min條件下離心30 min,保留酚相。在酚相中加入0.1 mol/L pH 8.8 Tris-HCl及0.01 mol/L DTT后再加入4 倍體積甲醇(含0.01 mol/L乙酸銨及0.01 mol/L DTT),-80 ℃沉淀1 h以上,4 ℃、12 000 r/min條件下離心30 min。沉淀用預冷的90%乙醇(含0.01 mol/L DTT)洗滌2~3 次,4 ℃、12 000 r/min條件下離心20 min。蛋白沉淀物室溫干燥后,加入溶解液

中,室溫混懸1 h,4 ℃、12 000 r/min離心30 min,上清即為蛋白質樣本溶液。

細胞破碎效果的顯微觀察

  將未作處理組、液氮研磨處理組、液氮研磨/超聲波處理組及液氮研磨/高壓均質處理組樣品的細胞破碎效果應用顯微成像系統進行觀察。



結論

  本研究采用超聲波與高壓均質破碎細胞, 通過Bradford法測定銀耳芽孢總蛋白質量濃度并進行SDS-PAGE分析,比較了Tris-飽和酚法、TCA-丙酮沉淀法及Tris-飽和酚結合TCA-丙酮沉淀法提取銀耳芽孢總蛋白的效果。結果表明:高壓均質破碎細胞的效果優于超聲波,Tris-飽和酚法在蛋白質量濃度及電泳條帶清晰度方面均優于其他兩種方法,因此Tris-飽和酚法是進行銀耳芽孢總蛋白提取的一種有效方法,可為銀耳蛋白質生理功能的研究及銀耳芽孢在食品加工中的應用奠定基礎,同時也為其他食用菌總蛋白的提取提供參考。









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