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破壁靈芝孢子粉的制備

[導讀]通過比較不同的破壁技術對靈芝孢子破壁率及有效成分溶出的影響,以期建立靈芝孢子的高效破壁工藝,并考察破壁靈芝孢子粉對小鼠免疫功能的影響。

  靈芝(Ganoderma lucidum)是擔子菌綱、多孔菌科藥食兩用真菌,在我國傳統中醫藥中主要以子實體入藥,臨床上主要用于治療慢性支氣管炎、冠心病、心絞痛、高脂血癥、神經衰弱、肝炎、白細胞減少癥等病癥[1]。近年來,對靈芝化學成分及臨床作用的研究較多,其中對靈芝孢子的研究引起廣泛關注。靈芝孢子含有比靈芝子實體更加豐富的多糖類、三萜類、脂肪酸類、氨基酸、多肽類、甾醇類、無機離子等活性成,F代藥理與臨床研究結果表明,靈芝孢子具有增強免疫、抗腫瘤、抗炎、保肝、降血清膽固醇、降血糖、抗輻射、抗病毒等功能,尤其在增強免疫、抑制腫瘤的藥效方面遠遠超過靈芝子實體。

  由于靈芝孢子的雙層壁是由幾丁質、纖維素、木質素和葡聚糖構成,且具有同心圓的層網結構,質地堅韌,耐酸堿、耐壓、耐高溫,極難分解,對消化酶也非常穩定。人體服用未破壁的靈芝孢子后極難被胃酸消化,也很難被腸道中的消化酶分解,導致有效成分很難被人體吸收利用。因此為了充分利用靈芝孢子內的有效物質,對孢子需進行破壁處理。目前雖有多種方法可對靈芝孢子進行破壁處理,如機械法、超聲波破壁法、生物酶法等,但采用這些方法破壁的同時,仍然存在一些有待解決的問題,如破壁率不高,有效成分難以溶出等。因此,高效破壁技術已成為靈芝孢子制劑開發和利用的關鍵因素。筆者通過比較多種破壁技術的破壁效果及破壁工藝的優化,以期提高靈芝孢子的破壁率,促進有效成分的溶出,增強免疫力。

材料與方法

  試驗材料ICR 雄性小鼠160 只,體重18~22 g,由揚州大學比較醫學中心(SPF級)提供,動物質量合格證號:SCXK(蘇)2012-0004。動物飼養于南京中醫藥大學動物中心SPF級小鼠實驗室內,溫度(23±2)℃,空氣相對濕度55%±5%,顆粒飼料為湯山龍泉牌實驗鼠顆粒飼料喂養,自由飲水。

  藥品與試劑注射用環磷酰胺(德國百特制藥公司);綿羊紅細胞(南京森貝伽生物科技有限公司);豚鼠血清(南京森貝伽生物科技有限公司);熊果酸對照品購于成都普菲德生物技術有限公司(批號:141021,HPLC檢驗含量>98%);葡萄糖對照品購于上海融禾醫藥科技發展有限公司(批號:131118,HPLC檢驗含量>98%),其它試劑均為國產分析純。

  試驗儀器貝利超微粉碎機(濟南倍力粉技術工程有限公司),超聲波粉碎儀(JY92-IIN,寧波新芝生物科技股份有限公司),球磨機(A5-05M,紹興市東晶機械儀器設備有限公司),恒溫水浴鍋(上海精宏實驗設備有限公司),超純水器(南京易普易達科技發展有限公司),酶標儀(PerkinElmer股份有限公司),電子天平(賽多利斯科學儀器有限公司),海爾醫用低溫保存箱(青島海爾特種電器有限公司)。

試驗方法

  破壁率的計算采用血球計數板法,在200倍光學顯微鏡下計數破碎與未破碎的靈芝孢子,破壁率=([ A-B)/A]×100%(A為破壁前完整孢子數,B為破壁后完整孢子數)。

總三萜含量測定

  對照品溶液的制備稱取熊果酸對照品適量,置于10 mL容量瓶中,加乙酸乙酯溶解,定容,搖勻,備用。得質量濃度為250 μg/mL熊果酸對照品溶液。

  供試品溶液的制備取破壁靈芝孢子粉0.1 g 置于100 mL 容量瓶,加入90 mL 乙酸乙酯超聲提取30 min,冷卻至室溫后定容至100 mL,過濾,即得供試品溶液。

  測定方法精密量取供試品溶液2.0 mL置于10 mL具塞試管中,100 ℃水浴蒸干,加入5%香草醛-冰醋酸0.4 mL 和高氯酸1.0 mL 搖勻,于60 ℃水浴加熱15 min,冰浴3 min后,加入5 mL 冰醋酸搖勻,放置15 min后于548 nm下測定吸光度。

總多糖含量測定

  對照品溶液的制備稱取葡萄糖對照品適量,置于100 mL容量瓶中,加超純水溶解,定容,搖勻,備用。得質量濃度為133.8 μg/mL葡萄糖對照品溶液。

  供試品溶液的制備精密稱取破壁靈芝孢子粉0.5 g 置于100 mL 錐形瓶中,精密加入80%乙醇40 mL,靜置2 h,超聲提取30 min,過濾,濾渣連同濾紙共同烘干,加入超純水100 mL,超聲提取30 min,100 ℃水浴1 h后,過濾即得供試品溶液。

  測定方法精密量取供試品溶液1.0 mL,置于10 mL 具塞試管中,加水至2.0 mL,加入硫酸蒽酮溶液(精密稱取蒽酮0.1 g,加80%硫酸溶液100 mL 溶解,搖勻)6.0 mL,搖勻,置水浴中加熱15 min后,冰浴中冷卻15 min,以相應的試劑為空白,在625 nm波長處測定吸光度。

破壁靈芝孢子粉的免疫活性

  免疫低下模型小鼠造模及給藥將試驗小鼠隨機分成8組,設空白組、模型組、超微粉碎的破壁靈芝孢子粉給藥組(高、中、低三個劑量)和未破壁靈芝孢子粉給藥組(高、中、低三個劑量),每小組10只小鼠,正常組和模型組每天灌喂生理鹽水0.1 mL/10 g,給藥組以人體推薦量的10倍為其中的一個劑量組,另設二個劑量組,具體為:低劑量組0.15 g/kg,中劑量組0.3 g/kg,高劑量組0.6 g/kg。每天分別灌喂給藥0.1 mL/10 g,共灌喂30 d。正常組腹腔注射生理鹽水0.1 mL/kg,模型組和各給藥組均于首次給藥后第1、3、5、17 和19 d 腹腔注射環磷酰胺40 mg/kg,每天1次,建立免疫功能低下小鼠模型。

  體重和免疫器官指數觀察每4~5 d給小鼠稱重并記錄,按劑量灌喂、造模,眼眶采血等操作完成后處死小鼠,解剖取出脾臟和胸腺,分別用生理鹽水漂洗后濾紙吸干,稱重并按下式計算臟器指數。

  遲發型變態反應— 綿羊紅細胞(SRBC)誘導小鼠DTH(足跖增厚法) 小鼠腹腔注射2%(v/ v)SRBC 進行免疫,每只鼠0.2 mL(約1×108個SRBC)。免疫后4 d,測量左后足跖厚度,然后在測量部位皮下注射20%(v/v)SRBC,每鼠20 μL(約1×108個SRBC),注射后于24 h 測量左后足跖部厚度,同一部位測量三次,取平均值。以免疫前后足跖厚度差值(足跖腫脹度)來表示DTH 的程度。

  血清溶血素的測定— 半數溶血值(HC50)測定法小鼠腹腔注射2%(v/v)SRBC進行免疫,每只鼠0.2 mL(約1×108個SRBC)。免疫后4 d,處死動物,小鼠眼眶取血,放置約1 h,使血清充分析出,2000 r/min離心10 min,收集血清,用生理鹽水將血清稀釋200倍。各組樣品管中分別加入1∶200試驗小鼠血清稀釋液1 mL、1∶10 補體血清稀釋液1 mL、以及10% SRBC 0.5 mL振蕩混勻,另取空白管,分別加入等量的補體、SRBC及1 mL生理鹽水。然后各管于37 ℃水浴鍋中孵育10 min,冰浴10 min終止反應,2000 r/min離心10 min,取上清液,以空白管調零,在540 nm處測定各管OD值,記錄結果。

  巨噬細胞功能的測定—小鼠碳廓清試驗采用碳粒廓清法,造模與給藥方法同1.4.4.1,連續給藥30 d后,經小鼠尾靜脈注入3倍稀釋的印度墨汁100 mL/kg。分別于2 min 和10 min從眼眶后取血20 μL,并將其加入到2.0 mL 0.1% Na2CO3溶液中搖勻,在578 nm波長處測光密度值,OD1表示2 min的光密度值,OD2表示10 min的光密度值。

結果與分析

  不同破壁方法對靈芝孢子破壁率及有效成分溶出率的影響靈芝孢子破壁后,顏色加深呈現棕褐色。顯微鏡下觀察未破壁的孢子壁光滑完整、豐滿,結構清晰,個體形態一致,呈卵形;破壁后,孢子壁不完整、內容物呈不規則塊狀。采用超聲波破碎法、球磨法、超微粉碎法三種不同的靈芝孢子破壁方法,隨著破壁時間的延長,孢子破壁率呈現上升的趨勢,在破壁時間達到45 min時,三種破壁方法的破壁

率基本上均達到最大值,其中超微粉碎破壁效果最好。隨著破壁時間的延長,總三萜和總多糖含量呈現先增加后減少的趨勢,30 min時總三萜和總多糖的含量達到最高值。其中超微粉碎破壁法更有利于靈芝孢子有效成分的溶出。綜合分析破壁率和有效成分的含量,采用超微粉碎破壁法,破壁時間30 min,破壁率達到96.97%,總三萜和總多糖的溶出量分別為34.16 mg/g和33.88 mg/g,分別比未破壁(總三萜13.13 mg/g±0.72 mg/g和總多糖6.91 mg/g±0.46 mg/g)提高了160.2%和390.0%。

  通過考察不同的破壁技術對靈芝孢子破壁率及有效成分溶出的影響,結果顯示超微粉碎法效果較好,且破壁靈芝孢子粉可顯著改善免疫低下小鼠脾臟的損傷,延緩遲發型變態反應,增加單核-巨噬細胞吞噬功能和血清溶血素含量,免疫增強效果明顯優于未破壁的靈芝孢子粉。








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