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超聲提取裝置-白蟲草多糖的提取

[導讀]本文用超聲水提法提取白蟲草多糖 .以單因素實驗為基礎 ,分析各提取因素對白蟲草多糖得率的影響 ,再用響應面法優化各研究因素間的交互作用 ,最終確定白蟲草多糖的最佳提取工藝參數。

蛹蟲草多糖具有多種藥理作用 ,如抗氧化 、免疫調節 、降血糖 、消炎和抗癌等 .由于多糖分子量較大且結構復雜 ,因此對其結構表征難度較大 ,目前多采用色譜和光譜等方法獲得多糖的分子量 、單糖組成及三級結構等信息 ,但過程復雜.分析多糖中單糖組成的方法較多 ,其中水解法使多糖中單糖相互間連接的糖苷鍵斷裂 ,釋放出單糖 ,再用色譜法對單糖進行定性定量分析 .常用的水解方法有硫酸水解法 、鹽酸水解法和三氟乙酸水解法等 .本文用超聲水提法提取白蟲草多糖 .以單因素實驗為基礎 ,分析各提取因素對白蟲草多糖得率的影響 ,再用響應面法優化各研究因素間的交互作用 ,最終確定白蟲草多糖的最佳提取工藝參數 .通過高效液相色譜(HPLC)法對白蟲草多糖的成分進行檢測 ,鑒定其主要單糖組成 ,并用 RAW264 .7 體外細胞抗炎模型對白蟲草多糖的抗炎效果進行檢測 .

實 驗

材料和儀器

 白蟲草產自吉林省白山市板石嶺長白山山脈 ;RAW246 .7 細胞由長春工業大學生物工程實驗室提供 .紫外分光光度計(北京普析通用儀器有限公司) ; HPLC 儀(美國沃特世公司) ;超聲提取裝置寧波新芝生物科技股份有限公司) ;酶標儀(濟南鑫貝西生物技術有限公司) ;細胞抗炎試劑盒(武漢默沙克生物) .

白蟲草多糖的提取

 稱取 50 g 白蟲草超微粉末置于燒杯中 ,加蒸餾水 500 mL ,攪拌均勻 ,以 20 ℃ ,1 000 W 超聲3 .0 h .超聲結束后先用紗布粗濾 ,再離心 ,將上清液濃縮至 200 mL ,于 4 ℃ 冷藏 .取濃縮后的上清液加入無水乙醇攪拌至溶液總體積為 1 L ,即乙醇的體積分數為 80% ,靜置 24 h .將醇沉后的沉淀收集 、干燥 ,得到白蟲草多糖 .分別對提取溫度 、超聲波功率 、提取時間和料液比(m(料) ∶ V (液))進行單因素實驗 ,每個因素分 3 組進行平行實驗 ,通過響應面法確定最佳提取工藝 ,其中提取率 = [粗多糖質量(g )/原料質量(g )] × 100% .

白蟲草多糖的分離純化

 將 200 g 白蟲草多糖超聲溶解于蒸餾水中 ,攪拌均勻后樣品于 500 r/min 離心 10 min ,除去不溶物 ,取上清液加樣到 DEAE Sepharose 色譜柱(20 mm × 300 mm)中 ,用蒸餾水及 0 .05 ,0 .1 ,0 .2 mol/L的 NaCl 溶液分別洗脫 240 min ,收集洗脫液(每管 5 mL ,1 mL /min) ,用苯酚-硫酸比色法在 490 nm處測定洗脫液 A 值(OD 值) ,繪制洗脫時間與 A 的關系曲線 .收集單一對稱峰 ,透析除去 NaCl ,濃縮后進行冷凍干燥 .重復上述分離操作以得到足夠的多糖樣品 .

白蟲草中多糖的質量分數測定

 用苯酚-硫酸比色法測定樣品中總糖的質量分數 ,以葡萄糖標準品為對照品 ,繪制葡萄糖的質量濃度 ρ(mg /mL)與吸光度(A)間的標準曲線 ,測定白蟲草多糖中總糖的質量分數.用咔唑-硫酸比色法測定多糖糖醛酸的質量分數 ,以葡萄糖糖醛酸為對照品 ,繪制標準曲線 ,測定白蟲草多糖中糖醛酸的質量分數 .用考馬斯亮藍染色法測定蛋白質的質量分數 ,以牛血清白蛋白為標準對照品 ,繪制標準曲線 ,測定白蟲草多糖中蛋白質的質量分數.

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