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新芝超聲-植物葉片染色質免疫共沉淀方法的優化

[導讀]以不同衰老程度的水稻旗葉為材料,根據上述破碎條件,進一步優化超聲破碎時間,同樣可以獲得合適的 DNA 片段,根據優化的樣品與抗體用量比例,通過免疫沉淀可以獲得適用于后期實時定量 PCR( ChIP-qPCR) 和高通量測序( ChIP-seq) 分析的 DNA 樣品.

  迄今為止,已有多種方法用于研究蛋白質與 DNA 的互作,染色質免疫共沉淀技術( Chromatin immunoprecipitation,ChIP) 是用于檢測蛋白質與 DNA 體內互作的有力工具.自創建 ChIP 技 術以來,ChIP 方法得到不斷改進和完善.ChIP 技術可與高通量測序( seq) 、基因芯片( chip) 、實時熒光定量 PCR( qPCR) 等技術聯合使用,廣泛應用于組蛋白修飾、核小體定位及轉錄因子結合位點檢測等方面. ChIP 技術的基本原理是在生物體生理狀態下,利用甲醛使細胞核內 DNA 和蛋白質緊密交聯,通過超 聲或酶試劑處理將染色質剪切成 200 ~ 1 000 bp 的小片段,利用特異性抗體沉淀與靶標蛋白結合的 DNA, 最后解交聯并純化 DNA 片段.雖然 ChIP 技術應用日趨廣泛,但 ChIP 試驗步驟繁瑣,多個因素限制了 ChIP 的效率.其中超聲破碎條件和免疫沉淀效率是影響該試驗能否成功的關鍵因素.樣品量、破碎時間、 功率及破碎強度等均能影響超聲破碎效率.以西紅柿為材料,探索不同功率對染色質片 段大小的影響,結果顯示功率為 20%時染色質片段最小最集中.與其他植物相比,擬南芥 ChIP 方法研究較為深入.較系統地探索了超聲破碎儀的破碎時間、功率、間隔時間對擬南芥染色質片段大小的 影響.利用另一型號超聲破碎儀,優化了擬南芥野生型和突變體幼苗的 ChIP 方法.但是不同超聲破碎儀器的條件需要重新設定和優化,并且不同植物其破碎條件也不盡相同.此外,抗體的親和性和用 量也是限制免疫沉淀效率的重要因素,因此不同樣品量對不同抗體的用量需要進一步確定. 植物染色質構象變化參與調控植物的發育、衰老和脅迫響應過程,組蛋白修飾作為一種重要的染色質 重塑機制之一,對基因的表達和抑制具有重要的調控作用.利用 ChIP 技術可以研究特定基因以及全基 因組范圍的組蛋白修飾的變化.本試驗以擬南芥成熟蓮座葉為材料,比較和優化不同超聲破碎儀器的破 碎條件,同時探索了組蛋白 H3 第 9 位賴氨酸乙;( H3K9ac) 抗體的用量對免疫效率的影響.利用上述最 適的超聲破碎儀條件和 H3K9ac 抗體用量,以水稻旗葉為材料進行 ChIP 試驗,獲得的 DNA 片段可以成功 用于后續的實時定量 PCR( ChIP-qPCR) 和高通量測序( ChIP-seq) 分析.

材料與方法

材料

  植物材料 植物材料是在人工氣候室培養的野生型擬南芥( Arabidopsis thaliana L. Columbia ecotype) 和水稻日本晴品種( Oryza sativa L. cv. Nipponbare) . 擬南芥生長條件為: 溫度 22 ℃,相對濕度 60% RH,光照時間 13 h,黑暗時間 11 h.選取抽薹后完全展 開的蓮座葉( 約 7 周) 作為試驗材料.水稻生長條件為: 溫度 28~32 ℃,光照時間 16 h,黑暗時間 8 h.水稻小 穗完全從葉鞘中抽出時,取其旗葉作為第 1 周的試驗材料,以后每隔 1 周取材 1 次,共取 6 次,分別記作 1 周、2 周、3 周、4 周、5 周、6 周. 1.1.2 儀器與試劑 本試驗所使用了 3 種超聲破碎儀器,分別為: scientz08-II ,Scientz08-III、Scientz-IID.其中 Scientz-IID探頭式超聲破碎儀,而其他兩 種破碎儀器為非接觸式超聲破碎儀. 熒光定量 PCR 儀型號: CFX Connect( BioRad) . Microcloth( 475855-1RCN) 、蛋白酶抑制劑 Complete Protease Inhibitor Cocktail( 04693116001) 購自羅氏 公司、抗體 H3K9ac( 07-352) 購自默克密理博公司.

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