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新芝生物細胞粉碎-蜂王漿質量評價和功能開發

[導讀]蜂王漿是一種對人類健康具有重要作用的天然功能食品,具有調節血壓、增強免疫力、抗菌消炎、抗腫瘤等藥理功效,其營養價值越來越受到人們的關注。蜂王漿成分復雜,主要包括水分、蛋白質、脂類、氨基酸、糖類、維生素等,其豐富的生物活性成分是蜂王漿具有醫療保健功效的物質基礎。

【研究意義】蜂王漿是由工蜂上顎腺和咽下腺等腺體共同分泌的乳白色或淡黃色的漿狀物質,是工蜂用來飼喂 1—3 日齡蜜蜂幼蟲和飼喂蜂王終生的食物。蜂王漿是一種對人類健康具有重要作用的天然功能食品,具有調節血壓、增強免疫力、抗菌消炎、抗腫瘤等藥理功效,其營養價值越來越受到人們的關注。蜂王漿成分復雜,主要包括水分、蛋白質、脂類、氨基酸、糖類、維生素等,其豐富的生物活性成分是蜂王漿具有醫療保健功效的物質基礎。代謝組學是對生物體、器官、組織或細胞中的代謝物進行全面系統鑒定和分析的技術,該技術在食品領域的應用,可對食品中的小分子組分進行整體定性和定量分析,為食品質量安全提供技術支撐。代謝物的提取是代謝組學研究中至關重要的步驟,直接影響了可檢測的代謝物范圍以及代謝物提取的數量。因此,建立簡單易行且高效的蜂王漿代謝物的提取方法,獲得更加全面的代謝物種類和數量,對蜂王漿質量評價和功能開發利用具有重要意義。

【前人研究進展】目前對蜂王漿小分子化合物的鑒定分析已有大量報道,檢測了蜂王漿中的揮發性成分和有機溶劑萃取成分,靶向測定了蜂王漿中的親水性化合物,但大多數研究只針對蜂王漿中的某一類化合物,如氨基酸、糖、有機酸、維生素及核酸。從分析方法來看,以上研究主要基于氣相色譜-質譜聯用技術(GC-MS)、氣相色譜火焰-離子化檢測器(GC-FID)、高效液相色譜-熒光檢測技術(HPLC-FLD)等。氣相色譜相關技術檢測范圍小,只能檢測揮發性化合物和衍生化后形成的揮發性化合物。超高效液相色譜-高分辨質譜技術(UPLC-HRMS)具有更高的分辨率和靈敏度,通過選擇不同的分離色譜柱可以實現從非極性到極性代謝物的全面檢測,其中反相液相色譜(reversephase liquid chromatography,RPLC)能夠很好地分離非極性和中低極性化合物,但對強極性化合物的保留和分離能力較弱,而親水相互作用色譜(hydrophilicinteraction liquid chromatography,HILIC)對強極性化合物有較好的分離和保留,具有與 RPLC 互補的選擇性。因此,RPLC 和 HILIC 相結合可以擴大代謝物的分離檢測范圍,與質譜聯用后可獲得更全面的代謝物種類及含量的信息。但 UPLC-HRMS技術在蜂王漿代謝物研究中的應用非常有限,而且只進行了靶向分析,非靶向的 RPLC-HRMS 和HILIC-HRMS 以及二者同時應用到蜂王漿中的研究還未有報道。代謝組學研究中,溶劑提取法是廣泛使用的代謝物提取方法,目前常用的樣品提取溶劑有甲醇、乙醇、乙腈以及與水組成的混合溶劑提取體系,不同溶劑對代謝物的提取會產生不同的影響。蜂王漿代謝成分復雜,化學性質和豐度差異大,提取溶劑的選擇至關重要,目前常用的提取溶劑有90%乙醇、50%甲醇、100%甲醇及 50%乙腈等,但缺乏系統的比較研究。

【本研究切入點】分別基于 RPLC 和 HILIC 聯合 Q-Exactive OrbitrapHRMS 以及代謝組學分析技術對蜂王漿中的小分子化合物進行全面分析,通過多元統計分析比較不同濃度(50%和 80%)的甲醇、乙醇和乙腈對蜂王漿代謝物的提取效果,優化蜂王漿代謝物的提取方法。

【擬解決的關鍵問題】建立并優化蜂王漿小分子化合物成分的高效提取方法,對蜂王漿中的小分子化合物進行全面解析,為后續蜂王漿代謝組學研究提供技術支持。

材料與方法

試驗于 2019 年在中國農業科學院蜜蜂研究所完成。

化學試劑

質譜級乙腈(A955-4)、質譜級甲醇(A456-4)、質譜級乙醇(24102)、色譜級甲酸(50144)和甲酸銨(A115-50)購自 Fisher Scientific,超純水由 Milli-Q純水機制備,化合物標準品購自 Sigma。

儀器設備

質譜儀( Q-Exactive ),美國 Thermo FisherScientific 公司;超高效液相色譜系統(Ultimate 3000),美國 Thermo Fisher Scientific 公司;臺式低溫離心機(Microfuge 22R Centrifuge),美國 BeckMAN CoulTER公司;電子分析天平(PL203,0.1 mg),德國 METTLERTOLEDO 公司;超低溫冰箱(MDF-U3286S),日本SANYO 公司;非接觸超聲波細胞粉碎機(Scientz08-III),寧波 SCIENTZ 公司;快速低溫冷卻循環機(DLK-2007),寧波 SCIENTZ 公司。均采用寧波新芝生物科技股份有限公司生產。




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